Хроматографы препаративные, GPC LC, системы аффинной хроматографии

Препаративная хроматография используются для получения целевых соединений высокой чистоты из смешанного раствора после реакции синтеза или из природных экстрактов. Обязательным элементом препаративной системы является наличие Коллектора фракций, который используется для сбора отдельных высокочистых соединений, необходимых для последующей оценки, анализа и обработки.

Гель-проникающая хроматография (ГПХ/GPC) – технология разделения растворённых макромолекул по размерам при прохождении через пористый гель колонок.

Использование ГПХ для измерения молекулярной массы и других характеристик, позволяет исчерпывающе характеризовать синтетические и природные полимеры.

Аффинная хроматография используется для выделения следующих видов веществ (в скобках указан вид применяемого при этом лиганда): -

• аналоги ферментативных ингибиторов, субстратов и кофакторов (ферменты);
• биоорганические вещества, обладающие признаками генетической чужеродности, вирусы и клетки (антитела);
• высокомолекулярные углеводы, полимеры моносахаридов, гликопротеины (лектины);
• ядерные белки, нуклеотидилтрансферазы (нуклеиновые кислоты);
• рецепторы, транспортные белки (витамины, гормоны);
• белки, взаимодействующие с клеточными мембранами (клетки).

Эта технология также используется для получения иммобилизованных ферментов, а привязка их к целлюлозе позволяет изготовить иммуносорбенты.

Разделение компонентов происходит следующим образом: рабочий раствор, содержащий вещество, которое необходимо выделить, пропускают через сорбент; лиганд, нанесенный на матрицу-сорбент, удерживает это вещество; происходит его концентрирование (накопление); извлечение выделенного вещества с сорбента при помощи вымывания растворителем. Данный способ позволяет выделить целые клетки. Отличием от традиционной сорбционной хроматографии является то, что существует прочное биоспецифическое связывание выделяемого компонента с сорбентом, характеризующееся высокой избирательностью. 

В качестве адсорбентов применяют следующие вещества:

• Гелеобразные составы на основе агарозы – полисахарида, получаемого из агара. Наиболее часто используют 3 разновидности: сефарозу 4 В, CL (сшитая агароза) и аффи-гель. Последний состав представляет собой модифицированный гель из агарозы и полиакриламида. Он обладает большей биологической инертностью, высокой химической и термической стойкостью.
• Кремнезем (силикагель).
• Стекло.
• Органические полимеры.

Для устранения механических препятствий при контакте лиганда применяют дополнительные вещества, отделяющие его от носителя (пептиды, диамины, полиамины, олигосахариды). 

Оборудование для аффинной хроматографии включает в свой состав следующие основные узлы: емкости-накопители для подвижной фазы (элюента); насосы высокого давления для подачи среды (чаще всего поршневые); фильтр для очистки элюентов от пыли; дозирующее устройство; хроматографическая колонна для разделения смеси; детектор для определения разделенных компонентов, выходящих из колонны; регистраторы хроматограмм и микропроцессорный блок (ЭВМ). С целью уменьшения количества растворенного воздуха через подвижную фазу предварительно пропускают гелий. Для изменения концентрации элюента устанавливают несколько насосов, управляемых программатором. Хроматографические колонны изготавливаются из нержавеющей стали (при повышенных требованиях к коррозионной устойчивости), из стекла (универсальный вариант) или из акрила. Для препаративных целей их диаметр может колебаться от 2 до 70 см. В аналитической хроматографии применяют микроколонки Ø10-150 мкм. Для повышения чувствительности детекторов в смесь вводятся реагенты, которые способствуют образованию веществ, которые больше поглощают лучи в ультрафиолетовой или видимой области спектра. 

Различают 2 основных вида жидкостной аффинной хроматографии:

• Колоночная, при которой колонну заполняют неподвижной фазой и через нее пропускают смесь с потоком элюента. Разделение может происходить под давлением или под в результате действия силы тяжести.
• Тонкослойная. Элюент движется по плоскому слою адсорбента под воздействием капиллярных сил. Адсорбент наносят на пластину из стекла, керамическую или кварцевую палочку, металлическую фольгу. Основные этапы работ включают в себя: подготовка адсорбента, фиксация лиганда на носителе; подача смеси для разделения в хроматографическую колонну; загрузка подвижной фазы, связывание компонента лигандом; замена фазы для выделения связанного вещества.

Хроматография ДНК-связывающих белков

Выделение ДНК-связывающих белков производится с помощью гепарина. Этот гликозаминогликан способен связывать большой диапазон молекул.

Аффинная хроматография белков данной группы используется для выделения таких веществ, как:

• факторы инициации и элонгации трансляции (синтез молекул нуклеиновых кислот и белков);
• рестриктазы (ферменты, узнающие определенные последовательности в двухцепочечной ДНК);
• ДНК-лигазы и полимеразы (ферменты, катализирующие соединение двух молекул с образованием новой химической связи и участвующие в репликации ДНК);
• ингибиторы сериновых протеаз, которые играют важную роль в иммунных и воспалительных процессах;
• факторы роста: фибробластов, Шванна, эндотелиальный; белки межклеточного матрикса; рецепторы гормонов; липопротеиды.

Данный метод является одним из самых специфических для выделения реакционноспособных соединений (ферментов и более крупных агрегатов – вирусов). Однако он используется не только для выделения биологически активных веществ. 

Выявление антител в малых количествах, количественная оценка полиадениловой кислоты, экспресс-определение молекулярных масс дегидрогеназ, удаление определенных загрязнителей, изучение кинетики активации неактивной формы трипсина, молекулярного строения интерферонов человека – вот далеко не весь перечень исследований, при которых применяется аффинная хроматография.

Применение в клинике обусловлено такими ее преимуществами, как:

• Возможность эффективной очистки белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот. Они незначительно отличаются по своим физико-химическим свойствам и теряют активность при гидролизе, денатурации и прочих видах воздействия, используемых в других методах.
• Быстрота разделения веществ, динамический характер процесса.
• Отсутствие необходимости в специальной очистке ферментов и гомогенизации изоферментов для определения констант диссоциации.
• Возможность разделения широкого круга веществ.
• Небольшой расход лигандов.
• Возможность разделения веществ в больших объемах.
• Обратимый процесс связывания биологических макромолекул.

Данную методику можно совмещать с другими, накладывать дополнительное поле (гравитационное, электромагнитное). Это позволяет расширить технические возможности хроматографии.

Ферментная инженерия

Аффинная хроматография применительно к выделению ферментов обладает следующими преимуществами:

• получение ферментов в больших количествах в результате меньших затрат времени, как результат – их удешевление;
• иммобилизация ферментов позволяет значительно расширить область их применения в медицине и промышленности;
• связь ферментов с нерастворимой твердой подложкой дает возможность изучить влияние микроокружения и направление реакций, которые играют важную роль в природных и физиологических процессах.

Материалы для скачивания

Препаративная ВЭЖХ - выбор подходящей конфигурации 

Сверхкритическая и препаративная хроматография. Решения Shimadzu для медицинской химии

Оптимизация аналитических условий и масштабирование от аналитического к препаративному масштабу с использованием сверхкритической жидкостной хроматографии 

Выделение и очистка белков (В.В. Сова, М.И. Кусайкин Дальневосточный ГУ)

Хроматографические методы очистки белков (информация с сайта Казанского Федерального Университета)

Металл-хелатная аффинная хроматография (сост.: И. С. Охрименко, В. В. Чупин. M. : МФТИ, 2014.)

Аффинная хроматография