Твердофазная экстракция - Метод подготовки проб, основанный на процессах распределения вещества между фазами в результате сорбционных или ионообменных взаимодействий.

Твердофазная экстракция традиционно используется для очистки и концентрирования проб воды с целью экологического мониторинга. Метод ТФЭ не требует применения больших объемов хлорированных и нехлорированных органических растворителей, необходимых для подготовки проб с помощью жидкостной экстракции и является удобным, недорогим и быстрым способом извлечения загрязнений из воды, альтернативным методу ЖЖЭ.

Для проведения твердофазной экстракции используются специальные картриджи (сорбционные патроны для ТФЭ) в виде шприца (Рис. 1), внутри которых между двумя пористыми пластинами- фритами (2) помещен определенный сорбент (3). Проба наливается в верхнюю открытую часть шприца и фильтруется через сорбент под действием гравитации, либо принудительно, при помощи специальных установок для вакуумной фильтрации. Отфильтрованный раствор стекает через узкую часть картриджа (4) в специальные приемники.

Рис. 1 Схематическое изображение картриджа для твердофазной экстракции

Принцип их использования следующий: Исследуемый образец растворяют в таком растворителе, который обладает незначительной элюирующей силой по отношению к анализируемым веществам. Полученный раствор пропускают через патрон, при этом более подвижные компоненты пробы в нем не задерживаются, в то время как целевые компоненты накапливаются в верхней части слоя сорбента.

Таким образом, через патрон можно пропустить довольно большой объем образца, превышающий во много раз объем сорбента в нем. По окончании этой операции колонку промывают небольшим объемом растворителя, обладающего значительной элюирующей силой по отношению к определяемым соединениям. В результате такой процедуры из образца удаляются механические примеси, слабосорбирующиеся и необратимо сорбирующиеся вещества. Получают фракцию небольшого объема, содержащую помимо целевых компонентов лишь фоновые компоненты, имеющие близкую хроматографическую подвижность.

В настоящее время, картриджи для твердофазной экстракции широко используются во многих лабораториях, что позволило значительно упростить и даже автоматизировать процедуры пробоподготовки. Многие стандартные методики определения малолетучих веществ, которые первоначально были рассчитаны на применение жидкостной экстракции, модернизированы в расчете на твердофазную экстракцию.

Одним из основных достоинств сорбционных патронов является высокая скорость сорбции и десорбции, что позволяет работать при повышенных скоростях элюирования анализируемого раствора или десорбирующего растворителя через слой сорбента. Методика ТФЭ и выбор патрона в значительной степени обусловлены свойствами определяемых веществ и составом матрицы.

Применение ТФЭ позволяет провести фракционирование пробы со сложной многокомпонентной матрицей. На последовательно соединенных экстракционных патронах можно одновременно выделять и разделять соединения различных классов: органические и неорганические, полярные и неполярные, ионные и т.д. Твердофазная экстракция позволяет более широко варьировать природу и силу специфических взаимодействий между сорбентом и компонентами матрицы по сравнению с жидкостной экстракцией, вследствие чего повышается избирательность выделения определяемых соединений.

В зависимости от объема пробы и свойств определяемого вещества твердофазная экстракция может быть проведена либо с помощью картриджей (патронов, заполненных сорбентами), либо на 96-луночных фильтрующих планшетах или на мембранных дисках.

Твердофазная экстракция основывается на тех же принципах, что и хроматография. По аналогии с последней, методы концентрирования с помощью ТФЭ можно классифицировать на нормально-фазовые, обращенно-фазовые, ионообменные, комплексообразующие и эксклюзионные.

Сорбционные патроны представляют собой разъемные капсулы из полиэтилена, полипропилена или фторопласта, заполненные гидрофобными сорбентами на основе активных углей, полимеров или силикагелей с привитыми алкильными, фенильными и нитрильными группами. Выпускают также патроны для ионообменной ТФЭ, содержащие сорбенты с привитыми аминными, аммониевыми и карбоксильными группами. Если первые применяют для выделения нейтральных органических соединений, то вторые - для извлечения органических кислот и оснований, а также катионов тяжелых металлов.

Однако следует учитывать, что емкость сорбентов на основе химически модифицированных силикагелей заметно ниже, чем полимерных аналогов, хотя вполне достаточна для концентрирования микропримесей. При групповом выделении СОЗ необходимо предварительно определить емкость патрона «до проскока» по исследуемому загрязнителю. Это особенно важно при определении следовых количеств веществ с высокой токсичностью, канцерогенностью или способных накапливаться в живых организмах, вызывая мутации.

Для концентрирования и извлечения неполярных соединений наиболее удобен метод обращенно-фазовой экстракции, когда сорбент имеет меньшую полярность, чем анализируемый раствор. Например, для выделения ПХБ из сточных вод применяют пористые стеклянные диски (толщина 90 мм, диаметр пор 1 мкм), модифицированные октадецилом. Они имеют высокую адсорбционную способность по отношению к ПХДД/ПХДФ и ПХБ, которые извлекаются из слоя сорбента толуолом. Для этих же целей применяют патроны «Sep-Pak», стеклянные микроколонки с сорбентом С18 и диски «Етроге» на основе сополимера С 18-стиролдивинилбензола.

Для ТФЭ характерно наличие более широких возможностей варьирования природы и силы специфических взаимодействий между сорбентом и образцом, чем для метода ЖЖЭ, вследствие чего происходит более селективное выделение или более тонкая очистка интересующих исследователя компонентов. За счет этих специфических взаимодействий можно селективно концентрировать из водных экологических проб каждое из определяемых соединений или отделять их от мешающих компонентов

При проведении ТФЭ можно осуществлять три варианта пробоподготовки:

• определяемые соединения концентрируются в патроне, а мешающие вещества проходят через него (Схема А);
• мешающие вещества удерживаются сорбентом, а определяемые соединения проходят через патрон (схема Б);
• мешающие вещества и определяемые соединения удерживаются сорбентом, но могут быть разделены при фракционном элюировании растворителями.

Рис. 2 Твердофазная экстракция основные принципы

Пробоподготовка при использовании трубок для ТФЭ включает четыре стадии

1. Кондиционирование (позиция 1 на рисунке 2 А/Б). Кондиционирование ТФЭ-трубки необходимо для активирования сорбента перед экстракцией пробы. Кондиционирование растворителями зависит от типа сорбента и цели его применения. Сорбент не должен быть сухой между стадиями кондиционирования и добавления пробы (позиция 2). В вертикально ориентированном патроне для ТФЭ над верхним фритом (пористым диском над сорбентом) трубки должно оставаться не менее 1 мл растворителя. Перед добавлением анализируемой пробы (позиция 2) в трубку для ТФЭ дополнительно вводят растворитель: по 0,5 мл в трубку на 1 мл, по 2 мл в трубку на 3 мл, по 4 мл в трубку на 5 мл. Если сорбент был высушен перед добавлением пробы, повторяют процедуру кондиционирования.

2. Добавление пробы. Количественный перевод пробы в ТФЭ-трубку осуществляют с помощью пипеток различной емкости. Общий объем анализируемой пробы может колебаться от микролитров до литров. Если экстрагируют большие объемы водных растворов, сорбент с обращенной фазой постепенно теряет растворитель, что снижает эффективность экстракции. При использовании ТФЭ-трубок с обращенной фазой для достижения максимальной эффективности экстракции объем водной пробы не должен превышать 250 мл.

Чтобы увеличить удерживание анализируемых соединений на насадке, необходимо элюирование или осаждение нежелательных соединений, регулирование pH, концентрации соли и содержания органического растворителя в растворе пробы. Чтобы избежать засорения фритов (пористых фильтров)катриджа, пробы перед экстракцией предварительно очищают фильтрованием или центрифугированием.

Для медленного (оптимального) прохождения водной пробы через экстракционную трубку используют вакуум или повышение давления. Скорость потока через трубку может влиять на удерживание целевых компонентов. В общем случае скорость не должна быть более 5 мл/мин, а если время не лимитировано, то лучше всего добавлять анализируемый раствор по каплям.

3 Промывание сорбента (позиция 3 на рис. 2 А). Если сорбент в экстракционном картридже задерживает целевые компоненты, промывание нежелательно. Обычно для промывки необходимо количество растворителя, не превышающее один объем картриджа. Чтобы сорбировать нежелательные (легко сорбирующиеся) соединения, нужно промывать сорбент более сильными растворителями, чем матрица пробы, но более слабыми, чем необходимо для выделения целевых компонентов. Типичный раствор может содержать меньше растворителя или неорганической соли, чем конечный элюент.

Эту стадию можно регулировать изменением величины pH. В качестве промывных растворов можно использовать также чистые растворители или смеси растворителей, достаточно отличающиеся по полярности от конечного элюента. Если используется процедура, в которой целевые компоненты не задерживаются сорбентом (см. рис. 2 Б), для удаления из ТФЭ картриджа остаточного количества вещества пробы используют количество растворителя, равное объему картриджа. Стадия промывки является также и стадией элюирования (см. п. 4), чтобы сделать более полной процедуру экстракции.

4. Элюирование целевых компонентов (позиция 4 на рис. 2 Б). Промывают сорбент колонки небольшим объемом раствора (200 мкл — 2 мл), который десорбирует целевые компоненты, но оставляет в ТФЭ-картридже некоторое количество анализируемых загрязнителей, которые не смываются при промывке водой. Элюат собирают и анализируют соответствующим образом.

Для экстракции (элюирования) целевых компонентов более эффективно использовать две порции раствора небольшого объема, чем одну большого. Извлечение аналита является наилучшим, если каждая порция раствора (аликвота) соприкасается с насадкой от 20 с до 1 мин.

Эти четыре стадии пробоподготовки можно изобразить более наглядно :

Рис. 3 Схема проведения твердофазной экстракции

Твердофазная экстракция: Методология ТФЭ с обращенной фазой

Обращенно-фазовая ТФЭ рассматривается как наименее селективный удерживающий механизм, по сравнению с нормально-фазной или ионо-обменной ТФЭ. Другими словами, применение обращенно-фазовой ТФЭ может вызывать затруднения при определении структурно похожих молекул. Тем не менее, постольку обращенно-фазовая ТФЭ способствует удержанию большинства гидрофобных молекул, она очень полезна для экстрагирования из образца аналитов, сильно отличающихся по своей структуре.

Основные этапы обращенно-фазовой ТФЭ

1. Предварительная обработка образца: Для снижения влияния примесей в сложной матрице (например, биологические жидкости), образец разбавляется  буферным раствором в пропорции 1:1. Манипуляции с pH образца могут иметь важное значение для соединений, способных ионизироваться. Ионизированное состояние соединений может резко изменить их характеристики удерживания и элюирования на конкретно взятом ТФЭ сорбенте. Когда аналит находится в нейтральной форме, он становится более гидрофобным и удерживание усиливается под действием условий обратной фазы. Регулирование pH образца в диапазоне ± 2 pH единицы от его pKa (в зависимости от функциональной группы) эффективно нейтрализует соединение.
   В случае работы с образцами биологических тканей или твердыми веществами, проводят твердо-жидкостную экстракцию или гомогенизацию с использованием буфера. Неполярные сольвенты (включая метанол и изопропанол) разрушают связи между соединениями и функциональными группами сорбента.
   Для того, чтобы избежать засорения абсорбента, необходимо центрифугировать, разбавить и/или предварительно отфильтровать образцы перед тем, как вводить их в сорбционные патроны.
2. Кондиционирование / Установка равновесия: Кондиционирование сорбционного патрона необходимо для смачивания и активации находящегося в нем адсорбента для того, чтобы функциональные группы сорбента могли взаимодействовать с аналитом. Сорбенты с обращенной фазой зачастую кондиционируют 1-2 объемами водорастворимых сольвентов, таких как метанол или ацетонитрил.
3. Внесение пробы: Внесите в патроны для экстракции предварительно подготовленный образец и снизьте скорость аспирации до 1-2 капель в секунду для получения оптимального значения удерживания.
4. Промывка: Во время загрузки образца в сорбционный патрон, примеси, содержащиеся в образце часто удерживаются вместе с определяемым целевым компонентном. Стадия промывки требуется для того, чтобы вымыть из абсорбента эти примеси, не затрагивая при этом целевое соединение. Обычно для этого применяют 5-20% раствор метанола в воде или буферный раствор.
5. Элюирование: разрушает гидрофобные связи между аналитом и функциональными группами сорбента при помощи неполярных органических растворителей или их комбинаций. Например, 2-3 объема метанола или ацетонитрила.
   Манипуляции с pH образца во время элюирования зачастую могут повысить степень восстановления, если речь идет об ионизируемых соединениях.В ионной форме основные и кислотные соединения становятся более полярными, ослабляется взаимодействие с обратной фазой, что позволяет использовать более слабые элюирующие сольвенты и снижать их расход.
6. Финишная обработка элюата: Часто необходимо испарить перевести ТФЭ элюат в мобильную фазу для последующего выполнения анализа методом жидкостной хроматографии. Для последующего анализа элюата методами газовой хроматографии, требуется его концентрация и, по возможности, смена матрицы на более летучий сольвент.

SPE TIPS – Наконечники для ТФЭ

1. Связи протеин-действующее вещество наркотического или лекарственного препарата должны быть разрушены в процессе предварительной подготовки к ТФЭ Для этого используют:
   • 40 мкл 2% Трилон Б (Дина́триевая соль этилендиаминтетрау́ксусной кислоты) на 100 мкл плазмы крови мыши
   • 40 мкл 2 % муравьиной кислоты на 100 мкл плазмы крови мыши
   • Другие допустисые реагенты (на 100 мкл матрицы):
     40 мкл 2% трихлоруксусной кислоты (TCA), 40 мкл 2% уксусной кислоты, 40 мкл 2% Трифторуксусной кислоты (TFA), 40 мкл 2% фосфорной кислоты, или 200 мкл ацетонитрила (MeCN, метил-цианин) (protein ppt.).
2. Если перед хроматографическим анализом ТФЭ элюат необходимо выпарить, после окончания элюирования ТФЭ картриджи подключают на 10 минут к устройству вакуумной сушки. В результате вакуумной сушки удаляются излишки влаги, которые могут замедлять испарение сольвента.
3. Последовательная и медленная (1-2 капли в секунду) вакуумная откачка на стадии загрузки образца и элюирования улучшают восстановление и воспроизводимость.
4. Снижайте вес сорбента для уменьшения объема элюата.
5. Увеличивайте вес сорбента для удерживания более полярных компонентов.
6. Озабоченность пересушиваием сорбента актуальна только при кондиционировании етанолом.
7. Предварительное кондиционирование картриджа сольвентом, таким как дихлорметан (или сольвентом, используемым для элюирования) может быть применено до стадии кондиционирования для удаления из ТФЭ картриджа примесей, которые могут влиять на последующие анализы.

Оборудование и принадлежности SUPELCO для твердофазной экстракции

Фирма Supelco выпускает сорбционные трубки для ТФЭ (объемом 1, 3, 6,12 и 20 мл) а также фильтрационные 96-луночные планшеты и фильтрующие диски, применение которых зависит от:

• объема пробы;
• сложности матрицы;
• количества контролируемых компонентов;
• силы (эффективности) растворителя по отношению к матрице и соединениям пробы;
• степени взаимодействия сорбент - аналит.

Supelco также предлагает устройства для вакуумной фильтрации ТФЭ картриджей, дисков и 96-луночных планшетов, приспособления для сушки картриджей и системы автоматического наполнения патронов для ТФЭ

В общем случае используют ТФЭ картридж объемом 1 мл, если объем пробы не более 1 мл; трубку объемом 3 мл, если объем пробы воды от 1 до 250 мл (и скорость элюирования не является критической) и трубку объемом 6 мл для быстрого элюирования (экстракции) проб объемом более 1 мл. Если анализируют пробы сложного состава, можно использовать трубку с большим количеством сорбента, например трубку объемом 3 мл вместо 1 мл, независимо от объема пробы.

Селективность ТФЭ картриджей по отношению к целевым компонентам определяется природой сорбента, что дает возможность выбрать сорбент, оптимальный для элюирования определенных целевых компонентов.

Экстракционные трубки для извлечения из воды органических соединений различных классов

1 - обращенная фаза; 2 - нормальная фаза; 3 - ионообменная.

В качестве модифицированных сорбентов для ТФЭ используются силикагели с привитыми октадецильными группами (С 18), октальными (С8), бутилдиметальными (С4) и фенильными (С-фенил) группами.

ТОО Лаборфарма предлагает оборудование и расходные материалы для твердофазной экстракции производства Supelco и Macherey Nagel.

Продукция для ТФЭ Supelco:

• Патроны (картриджи), фильтрующие диски и 96-луночные планшеты для твердофазной экстракции Supelco
• Вакуумные коллекторы для твердофазной экстракции Supelco Visiprep ™ SPE
• Вакуумный коллектор PlatePrep 96-well Vacuum Manifold (Supelco)

Продукция для ТФЭ Macherey Nagel:

• Системы твердофазной экстракции Macherey Nagel
• Вакуумный коллектор CHROMABOND Multi 96
• Автоматизированная SPE - CHROMABOND Macherey Nagel