Способы окраски микропрепаратов в микробиологии и гистологии
Окраска микроорганизмов - комплекс методов и приёмов микробиологической техники применяющийся для исследования внешнего и внутреннего строения микроорганизмов и позволяющий классифицировать их по видам. Метод широко используют в прикладной бактериологии для определения формы, размеров, строения, локализации, взаимного расположения микробов, структуры их органелл с целью диагностики инфекционных заболеваний. Не окрашенные микроорганизмы, кроме некоторых грибов, практически не различаются при помощи светового микроскопа , вследствие их малой контрастности. После обработки красителями, мембраны и/или органеллы микробов приобретают контрастирующую с фоном окраску.
Способы окрашивания разделяют на витальный, поствитальный и негативный, который может быть витальным и поствитальным.
Окраска микроорганизмов относится к цитохимическим реакциям, происходящим между компонентами микроба и красителем. Окрашивание происходит за счет специфического химического взаимодействия клеточных органелл с красителем или смесью красителей и других реактивов. В результате - появляется возможность определить вид микроорганизма, или хотя бы тип его мембраны.
Все красители, используемые для окраски микроорганизмов можно разделить на две группы: основные и кислые.
Основные красители содержат красящий катион и бесцветный анион, кислые состоят из красящего аниона и бесцветного катиона. Наиболее активны основные красители. Это обусловлено тем, что в обычных средах бактерии несут отрицательный поверхностный заряд, а внутри них содержатся вещества кислой природы (ДНК и РНК).
Так как красящая часть основных красителей несет положительный заряд, этот тип красителей обладает большим сродством к структурам микробной клетки, чем кислые, которые способны окрашивать клетку лишь при низких значениях pH. При обычных значениях pH кислые красители слабо фиксируются клеткой и легко удаляются из нее при отмывании. Поэтому кислые красители используются при так называемой негативной окраске, когда окрашивается фон препарата, на котором видны неокрашенные бактерии.
Кроме кислых и основных, существуют так называемые нейтральные красители, представляющие собой смесь кислых и основных красителей, в которой катион и анион обладают красящими свойствами. Следовательно, такой краситель способен окрашивать клеточные элементы, характеризующиеся как ацидофилией, так и базофилией.
Примером нейтрального красителя является краска Гимзы, применяемая для окраски спирохет и простейших. Следует отметить, что белковые структуры клетки при одних условиях могут быть окрашены кислыми, а при других - основными красителями, что обусловлено амфотерностью белков, т. е. их способностью вести себя как кислоты или основания в зависимости от pH среды.
Кислый или основный характер водного раствора красителя можно определить пробой с фильтровальной бумагой, которая имеет отрицательный заряд. При применении основного красителя его положительно заряженные молекулы будут фиксированы частицами бумаги и вода будет подниматься по бумаге в виде бесцветной полосы. Кислые красители, перемещаясь вместе с водой, будут окрашивать бумагу.
Наиболее широко распространены методы окрашивания микроорганизмов в препаратах, фиксированных термическим или химическим способами. Целью фиксации является обеззараживание препарата и прикрепление бактерий к поверхности предметного стекла. Термическую фиксацию (фиксацию жаром на пламени горелки) применяют для изучения морфологии микроорганизмов и эндогенных спор.
Xимическую фиксацию (фиксацию с помощью метилового спирта, этилового спирта, жидкости Никифорова и др.) применяют для окраски отдельных структур микроорганизмов - жгутиков, цитоплазмы и ядра клетки.
Методы окраски фиксированных препаратов подразделяются на простые и сложные.
К группе простых методов относят способы окраски одним основным красителем (метиленовый синий, метиловый фиолетовый, основный фуксин и др.). При этом все элементы препарата (клетки ткани, различные бактерии) окрашиваются в один цвет.
Применение туши при окраске микроорганизмов позволяет обнаруживать у бактерий капсулу (метод Бурри, метод Гинса). Классическим методом выявления биохимически дифференцированных структур микроба является метод Фейльгена - Россенбека, позволяющий определять наличие в бактерии ДНК.
С помощью этого метода было установлено, что бактерии содержат Нуклеоиды, являющиеся эквивалентами ядер клеток высших организмов.
Осмиевую к-ту применяют для окраски включений жира, йод для выявления крахмала, полихромный метиленовый синий для окраски зерен волютина и т. д.
Сложные методы окраски состоят из нескольких этапов химической или физической обработки препаратов с применением разных красителей. Пользуясь этими методами, можно дифференцировать одни микроорганизмы от других, идентифицировать отдельные элементы в пределах бактериальной клетки, а также отличить клеточный или тканевый фон препарата от содержащихся в нем бактерий.
Сложные методы окраски микроорганизмов широко используются при идентификации микроорганизмов.
Из этих методов широкое распространение получили методы окраски Грамма, Циля-Нельсона, Романовского-Гимзы.
Применение окраски по Граму позволяет условно разделить все бактерии на грамположительные и грамотрицательные в зависимости от того, устойчивы ли бактерии к обесцвечивающему действию ацетона, спирта или анилинового масла после окраски их красителями перифенил-метановой группы (генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиловый фиолетовый) и обработки препарата йодом.
При окраске методом Циля - Нельсена дифференцируют кислотоустойчивые бактерии от кислотоподатливых. Этот метод применяют при микробиологической диагностике туберкулеза.
Кислотоустойчивость микобактерий туберкулеза обусловлена высоким содержанием в них липидов, жирных к-т и многоатомных спиртов. Одним из липидов, постоянно обнаруживаемым в кислотоустойчивых бактериях и сохраняющим кислотоустойчивость в изолированном из клеток виде, является миколовая кислота. Однако признак кислотоустойчивости у бактерий, выявляемый окраской по методу Циля - Нельсена, теряется, если клетки подвергнуть механическому разрушению или лизису. Таким образом, Кислотоустойчивость обусловлена структурной целостностью клетки, содержанием в ней липидов и, возможно, их специфической топологией в бактериях.
Кроме перечисленных методов окраски микроорганизмов, существует способ выявления микробов, основанный на способности некоторых из них восстанавливать соли тяжелых металлов. Наиболее известным является импрегнация микроорганизмов азотистым серебром, которое восстанавливается микробной клеткой, придавая ей темную окраску. Этот способ применяли для выявления спирохет при диагностике сифилиза (Метод Левадити, метод Левадити — Мануэльяна) и для диагностики оспы путем обнаружения в исследуемом материале телец Пашена (Метод Морозова).
Метод Грама - метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.
По Граму бактерии окрашивают анилиновыми красителями - генциановым или метиловым фиолетовым и др., затем краситель фиксируют раствором иода. При последующем промывании окрашенного препарата спиртом, виды бактерий, имеющие толстую клеточную стенку, остаются окрашенными в синий цвет и называются грамположительными бактериями (обозначаются Грам (+)), а бактерии с тонкой клеточной стенкой не фиксирующей краситель после промывки спиртом и обесцвечивающиеся, – граммотрицательными бактериями (Грам (−)).
При окрашивании по Граму, после промывки спиртом, микробиологический препарат обрабатывается контрастным красным красителем, в результате чего все грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный или розовый цвет. Это происходит из-за наличия внешней мембраны, препятствующей проникновению красителя внутрь клетки.
Грамположительны кокковые (кроме представителей рода Neisseria) и спороносные (за исключением Coxiella burnetii) формы бактерий, они окрашиваются в сине-чёрный (тёмно-синий) цвет.
Граммотрицательны многие неспороносные бактерии, они окрашиваются в красный или розовый цвет.
Метод Грама - дифференциальная окраска бактерий; применяется для окраски бактерий в мазках из культур, экссудатов, тканей и пр. Метод предложен в 1884 г. и получил широкое распространение в бактериологии.
Сущность метода состоит в том, что при слабощелочной реакции бактерии окрашиваются основными красителями трифенилметановой группы (генцианвиолет, кристаллвиолет, метилвиолет). Обработка йодом или пикриновой к-той приводит к прочной фиксации красителя в определенных видах бактерий; последующее промывание окрашенного препарата нейтральным спиртом или ацетоном не обесцвечивает их (грамположительные бактерии). У других бактерий под влиянием йода не образуется прочного комплекса, и обработка спиртом или ацетоном приводит к обесцвечиванию. Эти бактерии (грамотрицательные) выявляются путем докрашивания контрастной краской. Грамположительность и грамотрицательность — важный диагностический признак в дифференциальной диагностике некоторых инфекционных заболеваний.
При окраске тканей по Грама методу клеточные структуры (за исключением хроматина делящихся ядер зернышек, базофильных клеток и рогового слоя эпидермиса) обесцвечиваются спиртом. Окраска по Граму вариабельна и зависит от многих факторов. Поэтому для получения точных и сравнимых результатов всегда следует придерживаться стандартной методики. Для фиксации препарата чаще используют высокую температуру, хотя могут быть применены и другие способы (см. Фиксация). Следует учитывать, что способ фиксирования влияет на ход окраски. Лучшими основными красителями для этого метода являются метилвиолет, генцианвиолет (см.) и др. Удовлетворительные результаты дают также основной фуксин, виктория синяя и др. В качестве протравы обычно применяют йод или пикриновую к-ту, но могут быть использованы бром, двухромовокислый калий, тринитрокрезол и др. Из обесцвечивающих агентов чаще применяют этиловый спирт и ацетон. Ацетон более активен в качестве средства, обесцвечивающего грамотрицательные бактерии. Используется также смесь из этих веществ.
Некоторые бактерии (Corynebacterium diphtheriae, Shigella dysenteriae, Bac. proteus) характеризуются грамнеустойчивостью, т. е. они находятся между безусловно грамположительными и безусловно грамотрицательными видами; отдельные клетки одного и того же вида также подвержены аналогичным колебаниям. Напр., в цепочке альфа-гемолитического стрептококка среди грамположительных кокков часто можно наблюдать грамотрицательную клетку. Особое влияние на окраску оказывает возраст культуры. Грампозитивность уменьшается с возрастом бактерии. Поэтому в старых культурах грамположительных видов обнаруживают большое количество грамотрицательных клеток. Мертвые и частично подвергшиеся аутолизу бактериальные клетки грамотрицательны. Результат окраски зависит от среды, в к-рой выращивается микроб. При оценке полученных данных, особенно в тех случаях, когда в грамотрицательных культурах обнаруживают грамположительные клетки, необходимо учитывать толщину мазка, влияющую на результат окраски. Желательно, чтобы толщина мазка была не больше толщины одной клетки, т. к. в толстом мазке, содержащем грамотрицательные микробы, часто наблюдаются грамположительные особи.
Техника окраски по Граму
Для окраски необходимо следующее: карболовый р-р красителя трифенилметановой группы (генцианвиолет, кристаллвиолет или метилвиолет); раствор Люголя (2 г йодистого калия, 1 г йода кристаллического, 300 мл дистиллированной воды) щелочной или нейтральной реакции; спирт 96% нейтральной реакции; р-р контрастной краски (фуксин Пфейффера, 1% водный р-р нейтральрота и др.).
Мазок, фиксированный жаром, окрашивают генцианвиолетом или другим красителем 1—2 мин., промывают водой и наливают на препарат р-р Люголя (на 1 мин.), после чего дифференцируют спиртом 7 г — 1 мин. до появления серо-фиолетовых струек краски. Затем препарат промывают водой и докрашивают одной из контрастных красок. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные бактерии, клетки и ткани - в красный. Предложены различные модификации метода Грама - А. И. Синева (применение генцианвиолетовой бумажки вместо карболового р-ра краски), Г. П. Калины, Хаккера (G. J. Hucker), Берк (V. Burke) и др.
Механизм окраски по Граму
Существует несколько теорий механизма окраски по Граму. Предполагалось, что грамположительная окраска обусловлена ненасыщенными жирными кислотами, имеющимися у некоторых бактерий и способными соединяться с йодом, в результате чего «эктоплазма» бактерий становится непроницаемой для спирта и извлечения адсорбированного красителя не происходит.
Другая теория [Стерн, Стерн (E. Stearn, A. Stearn), 1928] связывает механизм окраски по Граму с различиями в кислотно-основных свойствах протоплазмы у грамположительных и грамотрицательных бактерий. Эти две группы бактерий характеризуются различной изоэлектрической точкой (см.), которая у грамположительных видов находится при pH 2,0—3,0, а у грамотрицательных ок. 5. Наряду с этим следует указать, что протравы, применяемые при окраске (йод, пикриновая к-та, бихромат и др.), являются окислителями и имеют тенденцию превращать некоторые комплексы протоплазмы в более кислые соединения, сдвигая изоэлектрическую точку бактерий в кислую сторону. Свойство йода и других протрав сдвигать изоэлектрическую точку в кислую сторону у грамположительных бактерий выражено в большей степени, чем у грамотрицательных, что указывает на определенные хим. различия между этими микробами. Поскольку сродство к красителям и резистентность к обесцвечиванию тем сильнее, чем ниже Изоэлектрическая точка бактерий, а исходное значение pH у грамположительных бактерий ниже, чем у грамотрицательных, и после обработки йодом оно в значительной степени еще снижается, создаются условия для прочной фиксации краски.
Химическая теория [Хенри, Стейси (Н. Henry, М. Stacey), 1943] объясняет грамположительность наличием на поверхности цитоплазмы клетки комплекса из белка и рибонуклеата магния. Этот комплекс можно экстрагировать из тела грамположительных бактерий желчными солями и превратить их в грамотрицательные. Полученный таким способом грамотрицательный вариант можно вновь превратить в грамположительные добавив к нему выделенный экстракт. Превращение грамположительных бактерий в грамотрицательные происходит также при обработке убитых бактерий рибонуклеазой. Присутствие протеин-рибонуклеата магния на поверхности клетки доказывается тем, что успех окраски зависит от структурной целостности бактерий. При механических повреждениях, разрыве оболочки, раздавливании, растирании можно наблюдать превращение поврежденных бактерий в грамотрицательные. Грамположительность сохраняется у морфологически целостных клеток.
Имеются данные, свидетельствующие, что в конечном итоге окраска по Граму зависит от разной проницаемости клеточных стенок у грамположительных и грамотрицательных бактерий. В частности, указывается, что клеточная стенка грамположительных бактерий содержит больше пептидогликана, чем грамотрицательных бактерий, и, что особенно важно, пептидогликаны обеих групп бактерий структурно отличаются друг от друга. В пептидогликане грамположительных бактерий (Staphylococcus aureus) остатки N-ацетил мурамовой кислоты содержат О-ацетилгруппы в положении C6, что придает молекулам пептидогликана устойчивость, в частности к лизоциму. Высказывается предположение, что обработка спиртом при окраске по Граму уменьшает диаметр пор в пецтидогликановом слое у грамположительных бактерий в большей степени, чем у грамотрицательных.
В силу этого комплекс генцианвиолет - йод при обработке спиртом удерживаемся грамположительной клеткой и извлекается из грамотрицательной.
Окрашивание по Романовскому - Гимзе
Цитологический метод окрашивания микроорганизмов, клеточных структур, гистологических препаратов, и тканей различных видов (в том числе крови) для последующего их изучения методом световой микроскопии. В результате окрашивания препаратов по методу Романовского - Гимзе, ацидофильные образования приобретают различные оттенки красного цвета, а базофильные -окрашиваются в цвета от пурпурного до синего.
Метод Романовского-Гимзы - один из основных способов окраски мазков крови в гематологической практике. С его помощью хорошо выявляются как различные виды нормальных и патологических клеток крови, так и паразиты крови - малярийные плазмодии, трипаносомы, а также спирохеты, лейшмании, риккетсии, мигрирующие микрофиллярии и личинки нематод и др. .
Метод Романовского-Гимзы широко применяют для изучения клеток селезенки, костного мозга, однослойных клеточных культур.
В микробиологии Романовского-Гимзы метод во многих случаях способствует обнаружению тонких деталей строения бактерий, например, их капсул и метахроматических гранул.
В основе метода лежит обнаруженный в 1890-1891 гг. Д. Л. Романовским эффект изменения свойств смеси эозина с водным раствором метиленового синего при длительном контакте с воздухом (смесь при этом окрашивает цитоплазму клетки в синий цвет, а ядра - в красный, тогда как при раздельном применении красителей эозин окрашивает цитоплазму в розовый цвет, а метиленовый синий - ядра в синий). Этот феномен связывают с окислением и отщеплением метильных групп метиленового синего, в результате чего образуются производные красителя и некоторые дезаминированные продукты, способствующие появлению в препаратах полихромазии.
В 1905 г. Гимза предложил способ промышленного получения продуктов окисления метиленового синего в чистом виде (азур I) и в смеси с метиленовым синим (азур II) и разработал рецепт смеси этих красителей с водорастворимым эозином. Такая смесь (краска Гимзы) поступает в продажу в виде порошка или готового 0,8-1,1% основного раствора азур-эозина, состоящего из сухой краски и равных объемов химически чистых глицерина и метилового спирта.
Мазки для окраски по Романовского-Гимзы методу лучше фиксировать в метиловом спирте, срезы тканей - в смесях, содержащих хром. Непосредственно перед употреблением основной раствор краски разводят дистиллированной водой или буферным раствором. Степень разведения и показатель pH зависят от объекта исследования. Окраска мазков длится 20-40 мин. и более, срезы тканей обычно перекрашивают (до 24 час.) и затем дифференцируют в 96% этиловом спирте.
После окраски мазки высушивают, срезы быстро обезвоживают и заключают в бальзам. В результате окраски хроматин ядер приобретает красно-фиолетовый, эозинофильные гранулы - красно-коричневый, нейтрофильные гранулы - фиолетовый, базофильные зерна - синий цвет.
Цитоплазма моноцитов и лимфоцитов синяя, иногда с пурпурнокрасной так называемой азурофильной зернистостью, тромбоциты синие с пурпурно-красными грануломерами, эритроциты розовые, ядра паразитов крови ярко-красные. Результаты окраски могут варьировать в зависимости от pH среды.
Метод Пешкова
Применяется для детального изучения структуры грамположительных бактерий. Высушенный препарат фиксируют в жидкости Карнуа в течение 15 минут, затем промывают водой, наливают метиленовый синий по Леффлеру и нагревают до появления паров, кипятят строго не более 15—20 секунд, после охлаждения препарата промывают и докрашивают 0,5 % водным раствором нейтрального красного или фуксина по Пфейферу 30—60 секунд. Высушивают с помощью фильтровальной бумаги и микроскопируют с иммерсионной системой.
В результате окрашивания методом Пешкова, зрелые эндоспоры приобретают голубой цвет, молодые - тёмно-синий, цитоплазма – красный цвет, зёрна хроматина - фиолетовый цвет.
Метод Циля — Нильсена
Метод окраски микроорганизмов для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулёза, микобактериозов, лепры), актиномицетов, нокардий и других кислотоустойчивых микроорганизмов.
Кислотоустойчивость микроорганизмов обусловлена наличием в их клетках липидов, воска и оксикислот. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведёнными растворами анилиновых красителей.
Для облегчения проникновения красителя в клетки микроорганизмов необходимо добавление протравляющих веществ, которые, нарушая проницаемость липидной оболочки микробной клетки, делают ее доступной действию красящего раствора. Нанесённый на препарат карболовый фуксин Циля подогревают над пламенем горелки до появления пара. Гистологические препараты (срезы) красят 10-15 минут при комнатной температуре. После окраски фуксином препарат обесцвечивают 25% серной кислотой, промывают дистиллированной водой и докрашивают 1 - 2 минуты 0,5% водным раствором метиленового синего. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта. В результате обработки препарата по методу Циля - Нельсена кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в яркий рубиново-красный цвет, остальные составные части препарата, в том числе некислотоустойчивые бактерии, — в синий цвет.
В мазках из очень молодых или старых культур микроорганизмов обнаруживаются наряду с красными более бледные с фиолетовым оттенком клетки, что указывает на их меньшую степень кислотоустойчивости.
Из современных модификаций метода Циля-Нельсона заслуживает внимания метод приготовления мазков из мокроты с использованием их предварительной обработки глутаровым альдегидом, который вызывает гибель микобактерий туберкулеза.
Метод Морозова - метод обнаружения путем импрегнации серебром вирусов из группы возбудителей натуральной оспы и оспоподобных заболеваний.
Метод Морозова также применяли для окраски и выявления микроструктур бактерий (жгутиков, включений и гранул). Он представляет собой модификацию метода серебрения, предложенного в 1913 г. Фонтаной и Трибондо для окраски спирохет.
Метод Морозова основан на том, что при обработке препарата аммиачным раствором серебра соль восстанавливается и специфические структуры объекта выделяются как коричневато-черные образования на бесцветном или желтоватом фоне. Морозова метод пригоден только для окраски мазков или мазков-отпечатков, полученных в возможно тонком слое (обычно на предметных стеклах толщиной ок. 1,0—1,1 мм, применяемых для микроскопирования в темном поле).
Возможна также вирусоскопия препаратов, окрашенных по методу Морозова, с применением фазово-контрастной или темнопольной микроскопии.
Метод Бурри - негативный метод исследования неокрашенных бактерий на окрашенном фоне.. Предложен в 1909 г.
По С.И. Златогорову (1916), B.C. Калинину и С.И. Гинзбург, вполне удовлетворительные результаты получаются при употреблении чертежной черной туши, которую вдвое разводят дистиллированной водой. Каплю разведенной туши наносят на обезжиренное предметное стекло и эмульгируют в ней каплю исследуемого материала. Ребром покровного стекла из смеси делают мазок подобно мазку крови. Мазок быстро высыхает. Его исследуют, применяя гомогенную масляную иммерсию. Обычно иммерсионное масло наносят на мазок, не прикрывая его покровным стеклом. Лучшие оптические условия наблюдения достигаются в том случае, если иммерсионное масло капнуть на мазок, прикрыть его покровным стеклом толщиной 0,17 мм и на стекло нанести иммерсионное масло, в которое погружают объектив.
Работая по Б. м., следует иметь в виду, что бактерии в препарате остаются живыми. Поэтому при работе с патогенными бактериями необходимо соблюдать особую осторожность, выполняя правила безопасности и последующего обеззараживания исследуемых препаратов.
Препарат, при заключении его в иммерсионное масло по вышеприведенному способу, можно изучать при помощи любой сильной сухой системы, что дает преимущество в отношении большего поля просматриваемого препарата.