Оборудование для выделения ДНК

Выделение нуклеиновых кислот

В процессе проведения ПЦР применяют различные методы выделения нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) из исследуемого материала специфика которых связана с поставленной задачей. На этом этапе также производится удаление или нейтрализация посторонних примесей.

Для выделения нуклеиновых кислот используют три наиболее распространенных метода:

• Экспресс-метод выделения ДНК заключаются в разрушении (лизисе) клеток при помощи высокой температуры (в твердотельных термостатах) и последующем отделении содержащей фрагменты ДНК жидкости от нерастворимых компонентов путем центрифугированиия. Содержащая ДНК надосадочная жидкость (супернатант) используется для последующей амплификаци ПЦР.
  К преимуществам метода относится скорость (10-15 минут), доступность и обеспечение максимального выхода ДНК. Недостатком метода является невозможность его применения для выделения РНК (РНКазы устойчивы к нагреванию) и низкую эффективность при работе с материалами, с высоким количеством примесей и ингибиторов ПЦР. При работе со сложными образцами возможно введение дополнительных способов очистки и концентрации материала

Более эффективным методом выделения и очистки нуклеиновых кислот (НК) при работе с таким материалом может быть использование сорбентов или сильных хаотропных агентов.

• Сорбентные методы выделения включают дифференциальную сорбцию нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) на твердом носителе (силикагель с повышенным отрицательным зарядом или модифицированной поверхностью, стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко» и т. д.). Нуклеиновая кислота обратимо связывается со стеклом в присутствии высокой концентрации хаотропных солей (например, гуанидин тиоцианат). Ингибиторы и другие компоненты клинического материала остаются в растворе. Кроме хаотропных солей в лизирующем буфере чаще всего присутствуют детергенты, которые способствуют растворению и лизису белков.

Последующее центрифугирование  позволяет отделить сорбенты, содержащие нуклеиновые кислоты, от супернатанта c ингибиторами ПЦР. Серия отмывок позволяет получить высокоочищенный препарат нуклеиновых кислот.

• Выделение нуклеиновых кислот на магнитных частицах в ручном или автоматическом режимах представляет собой модификацию сорбентного метода. Применение магнитных твердых носителей в сравнении с немагнитным разделением дает ряд преимуществ.  Для выделения нуклеиновых кислот используют носители с магнитными свойствами (синтетические полимеры, биополимеры, пористое стекло, оксид железа с модифицированной поверхностью и другие) с высокой аффинностью к конкретной нуклеиновой кислоте. После связывания растворенной НК с материалом сорбента, к стенке пробирки, содержащей образец,  прикладывается магнит, который удерживает возле стенки намагниченный сорбент с НК; остаток образца можно слить. Таким способом можно отделять компоненты клеточного лизата, которые ингибируют ДНК-полимеразу и ПЦР. При этом можно выделять как ДНК, так и РНК с высоким выходом продукта из образцов, содержащих значительное количество примесей.
  
  Сорбентные методы выделения нуклеиновых кислот обеспечивают высокую степень их очистки, однако в процессе может произойти с потеря части нуклеиновых кислот вследствие необратимой сорбции на носителе или в процессе нескольких промывок. Кроме того, остаточное количество сорбента в конечном растворе ДНК может ингибировать ферментативные реакции ПЦР. Это особенно критично в случае низкого содержания НК в образце.
• Спиртовое осаждение (преципитация) – метод, основанный на агрегации ДНК и РНК в присутствии соли и спирта. После осаждения спиртом, НК отделяется от раствора центрифугированием. Осадок, содержащий целевую НК, неоднократно промывается спиртами и концентрируется центрифугированием. Далее, производят растворение НК в водном буфере, при нагреве до 55–65 °С для лучшего растворения осадка.

Преимуществом спиртового осаждения является возможность выделения как ДНК так и РНК, возможность работы со «сложными» образцами.
Недостатком метода заключается в одновременной преципитации белков вместе с нуклеиновыми кислотами, что затрудняет получение чистого препарата.